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磁珠捕获结合CE-LIF进行快速样品制备和单抗药N-端糖链的分析
(发布日期:2017-4-24 9:54:22)  浏览人数:1657
磁珠捕获结合CE-LIF进行快速样品制备和单抗药N-端糖链的分析
 
 
现代制药领域增长最快的是生物治疗性药物。随着大量原研生物药的专利即将到期,越来越多的生物仿制药和生物改良药产品,主要是单克隆抗体药物(mAbs)正在开发中。这个全球新兴的生物制药市场需要高灵敏度和分辨率的生物分析技术对产品进行表征,包括分析重要的翻译后修饰,如糖基化。在生物药物产品开发链的各个环节,均需要快速表征的方法,而糖基化正是其中的一个关键质量属性(CQA) 。因此在单克隆抗体药物生产过程中的所有步骤,均应密切监测其糖型。
 
单克隆抗体的糖基异构化主要取决于使用的宿主细胞系和表达条件。结构的多样性包括是否存在核心糖链的岩藻糖基化、不同的半乳糖苷化和唾液酸化以及二等分的N-端乙酰葡糖胺的存在。Fc端的CH2区保守糖基化结构(图1)影响生物活性、理化性质、抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒(CDC)。
 
1. 左图为IgG1的结构图,右图为FcCH2区保守的糖基化结构
 
由于糖基参与所有关键的生物过程,因此糖型对于功能关系应视为质量源于设计(QBD)过程中的一部分。例如,核心岩藻糖基化是对ADCC的功能起到反作用的关键影响因素(较低的岩藻糖基化增强ADCC的功能)。二等分的N-乙酰葡糖胺GlcNAc的存在也会增加ADCC的功能。末端唾液酸化影响抗炎特性,而半乳糖基化提高CDC功能。在治疗性抗体药物中,对某些免疫原性糖残基,如α1-3半乳糖和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的微量分析也是非常重要的。对所有这些糖基化特征的深入分析需要贯穿生产过程中的每一个步骤,从克隆筛选到转染、细胞扩增、工艺过程开发生产和纯化,如图2所示。可能影响重组糖蛋白糖基化过程差异的因素有:宿主细胞系中加工酶的表达水平、单糖核苷酸供体的水平、细胞信号转导途径如细胞因子/荷尔蒙、培养基组分以及由于pH变化、基因突变、沉默和过表达造成的细胞器组织缺失和生物生产过程中的环境(温度,氧含量等)。因此,使用适当的分析工具来确保产品具备必需的糖基化,对于保证产品最佳的活性是很关键的。
 
2. 重组治疗性抗体生产过程中涉及糖基化的主要步骤
 
用于表征治疗性蛋白N-端糖基化的方法有很多种,最常见的如毛细管电泳(CE),液相色谱(LC),质谱(MS)和核磁共振(NMR)。毛细管电泳技术(图3)的优势在于分离速度快,分辨率高和检测灵敏高。一直以来,很多生物制药企业利用毛细管电泳的多种模式结合紫外检测或荧光检测方法进行对单抗的表征,如毛细管区带电泳表征单抗的纯度和异质性,毛细管等电聚焦检测单抗的等电点和电荷异质性,毛细管凝胶电泳用于糖基化分析。并且研究探索了上述各毛细管电泳方法在不同实验室和不同操作人员间的可转移性以及优异的稳定性。
 
3. 配置激光诱导荧光检测器的PA800 plus生物制药分析系统
 
本文将介绍一种磁珠辅助的样品处理方法,对治疗性单克隆抗体N-端糖基化进行快速的分析。所有的样品制备过程都可使用自动化的液体处理器完成,无需离心和过夜孵育。全部样品制备过程仅需要不到四个小时即可完成。
 
实验设计
化学试剂:IgG,醋酸,硼氢化钠(1M in THF)购于Sigma Aldrich St. Louis, MO),8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(APTS),N-CHO Carbohydrate分离胶缓冲液,麦芽低聚糖标准品和Agencourt CleanSEQ 磁珠由贝克曼提供,PNGase F酶由ProZyme提供,酶解反应混合物按照厂家的说明书准备。
 
样品制备:根据厂家提供的PNGase F反应说明书,用PNGase F快速酶解糖基,50℃孵育1小时。之后加入200 μL磁珠(Agencourt CleanSEQ)的乙腈悬浮液(最终乙腈浓度为87.5%),磁珠可从多肽链和糖类内切酶的混合物中将酶切下来的糖基捕获。通过充分混合,将含有糖基磁珠混合物的离心管放入强磁场中进行快速分离。弃去上清液,向离心管中加入21 μLAPTS40 mM20%的醋酸中),以洗下捕获在磁珠上的寡糖链。
 
洗脱结束后立刻加入7 μL硼氢化钠(1M in THF)进行还原胺化反应。反应混合物在37℃孵化2小时,然后用酶解反应中相同的磁珠 (Agencourt CleanSEQ)去除多余的染料,乙腈的最终浓度为87.5%。弃去上清液,加入25 μL水,将离心管放置在强磁场中,将APTS标记的糖基从磁珠上洗脱下来。含有APTS标记糖基的上清液用于CE-LIF分析。
 
毛细管电泳:实验使用的毛细管电泳仪为PA800 plus(由AB SCIEX提供),配置激光诱导荧光检测系统(激发波长488 nm,发射波长520 nm)。N-CHO分离毛细管的有效长度为50 cm60 cm毛细管总长,50 μm内径)。施加的电场强度为500 V/cm,运用反向电压(进样端为阴极)。1psi6.89 kPa)压力进样5秒。用32 karat工作站进行数据的采集和分析。
 
结果和分析
单克隆抗体的全面糖基化分析是一项具有挑战的任务,因为糖类通常具有非常复杂、多样化的结构。此外它们不具备任何的生色和荧光基团,不能使用液相分离技术的常规的检测手段进行检测。此外,大部分糖基结构不带电荷,在电场下很难进行分离。糖基检测的方法有核磁共振、质谱、高效液相色谱、毛细管电泳或联用技术(LC-MSCE-MS)。其中,毛细管电泳结合激光诱导荧光检测可以很容易的解决上述问题,提供耐用、高效和高重现性的糖型分析方法。毛细管电泳的快速分析也适用于高通量的分离模式。与LC和大多数基于质谱检测的方法相似,使用毛细管电泳技术也需要进行样品的分离前的标记。APTS是毛细管电泳中最常用于糖分析的标记物,它可以在快速电泳迁移中提供荧光信号和分离必需的电荷。APTS与糖通过简单的一步反应形成的稳定结合物,APTS只能与糖的还原末端反应,因此保证了定量准确性(每个糖链结合一个荧光分子)。APTS的荧光特性使其可以使用PA800 plus中的488 nm激发的激光诱导荧光进行检测。
 
糖基的释放和荧光标记:首先要用合适的酶,PNGase F,将糖基从多肽上切割下来。针对于样品制备的要求,进行了孵育时间和温度的优化。糖基释放的优化条件是50℃孵育1小时。
 
同样,对APTS的标记条件也进行了优化。尤其要注意避免不稳定糖基的损失,如末端唾液酸。在这一步,反应温度为37℃,时间为2小时,保证了有效地标记并且没有任何明显的唾液酸损失(<2%)。另外,也对其他的标记反应条件如醋酸(催化剂)和APTS的浓度进行了优化(分别为20%40 mM)。在克隆筛选中,需要用到自动化工作站进行高通量的分析,此时反应体系的体积要超过15 μLAPTS浓度的选择是兼顾了这一因素而优化得来的。
 
基于磁珠的样品制备过程:糖基释放和标记步骤后要进行纯化,分别去除剩下的糖蛋白的肽链,糖类内切酶和过量的标记试剂。通常需要乙醇沉淀(PNGase F酶切后),使用葡聚糖柱Sephadex或正相色谱(用于去除过量APTS),离心和浓缩等步骤。在此,我们采用基于贝克曼磁珠(Agencourt CleanSEQ)的方法,去除了上述这些步骤。磁珠之前主要用于DNA的纯化过程,它的主链是由糖构成的,因此我们将它用于糖的捕获。脱氧核糖核酸分子的主链是由糖构成。磁珠可用于糖基释放和标记反应这两个过程的纯化,如将释放后的糖链捕获分离,和经过APTS标记后从反应混合液中捕获标记后的糖。
 
在整个样品制作过程中,利用磁珠进行分离,避免了任何离心的步骤,可用于高通量的检测,如图4所示。步骤A是使用PNGase F酶在50℃下酶解1小时(图4,步骤A)。随后加入乙腈(终浓度87.5%)停止反应。在这一阶段,释放的糖链通过亲水作用结合到磁珠上,磁珠在磁场下吸到瓶底(图4,步骤B)。
 
去除上清液后,加入APTS反应混合物(40 mM APTS20%醋酸),从磁珠上释放糖基,这种方式可避免传统前处理过程中使用真空离心法进行预浓缩的步骤(图4,步骤C)。加入反应试剂(1 M 氰基硼氢化钠于四氢呋喃中)后在37 ℃孵育2小时,再次加入终浓度87.5 %的乙腈终止反应。与前面步骤相同,捕获磁珠上标记的糖基。磁珠以及其捕获的标记的糖基在磁场下吸到瓶底(图4,步骤D)。去除上清液后,通过打破亲水性的相互作用使磁珠与标记的糖基进行分离(图4,步骤E)。磁珠在强磁场中沉下来,将上清液中的APTS标记的糖基进行CE-LIF的分析(图4,步骤E)。
 
4. 基于磁珠的样品制备流程
 
5展示了以磁珠辅助样品制备的效果。谱图ab分别描述了APTS标记的单抗N-糖样品在磁珠纯化前后的电泳图。从电泳图中可以明显看出,磁珠纯化步骤将几乎所有过量的APTS有效去除(迁移时间5-8 min区域),没有造成APTS峰与糖基峰的重叠。表1描述了主要的IgG糖基的结构(峰1-6)。
 
5. CE-LIF验证磁珠法纯化APTS标记糖基的有效性。a)未纯化的糖基;b)磁珠法纯化的糖基。条件:N-CHO毛细管(50 /60 cm有效/总长度,内径50 μm),LIF检测器:激发/发射波长:488/520 nm,电场:500 V/cm,进样:1 psi / 5 sec
 
1. IgG的主要糖基结构
 
最重要的是,在去除过量的染料后,峰分布仍然一样(表2),表明基于磁珠分离纯化的过程在糖基分析中没有产生任何捕获/释放歧视。另外,磁珠处理的样品可以提供清晰的CE-LIF分析的电泳图谱。
 
整个样品制备过程从糖的释放到电泳分析不到四个小时,表3描述了工作流程中各个步骤所需的时间。
 
2. 两种标记方法中峰分布的对比
 
3. 磁珠纯化法各步骤的时间
 
结论
本文介绍了磁珠辅助的快速高效的样品制备技术用于CE-LIF的检测来分析治疗性单克隆抗体药物的N-糖基化的糖型。整个糖蛋白样品制备时间少于四个小时,并避免了真空离心等操作步骤,可与自动化工作站兼容用于大量样品的高通量分析。此外,这一方法的额外优势在于糖基的标记反应均一(无歧视),以及可采用电动进样方法,使得高唾液酸化的糖型可被清晰的分离检测出,避免与过量APTS染料的共迁移而产生干扰。
 
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