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CESI-MS技术结合中性涂层OptiMS毛细管对完整rhEPO的糖谱进行高灵敏高分辨的分析
(发布日期:2017-2-4 10:06:18)  浏览人数:1812
CESI-MS技术结合中性涂层OptiMS毛细管对完整rhEPO的糖谱进行高灵敏高分辨的分析
 
 
引言
 
EPO是由肝脏分泌的一种促进红细胞生成的蛋白类激素。它也是第一种治疗性的重组蛋白,EPO是高度糖基化的蛋白,分子量大约为30 kDa,其中40 %的分子量与糖基化修饰有关1。它有三个N-糖修饰位点,分别为:Asn24Asn38Asn83。此外在Ser126位点连有一个O-糖。由于糖型的异质性(图1)导致它的糖谱分析具有很大的挑战性。rhEPO经过了广泛的研究,采用的分析方法也多种多样,其中包括CE以及nano LC与质谱联用技术2-3。但是这些方法往往需要引入一些酶解过程,会产生一些假的信号。因此在完整蛋白的条件下表征这些生物分子是十分有必要的。电泳是分析非变性的完整蛋白的一种可信赖的工具。最近发展出来的CESI-MS技术将电泳和电喷雾整合在一个动态范围里,在一套装置上实现了电泳和电喷雾的同时进行。通过这种CESI-MS技术,我们可以在pH=21的条件下对完整的EPO进行糖谱分析。在这个工作中,我们使用中性涂层的毛细管,将CESI-MS技术与高分辨高准确度的质谱联用,在非变性条件下对rhEPO的多种糖型进行了测定。此外我们采用部分酶解(Middle-Down)的策略研究了特定位点的N-糖和O-糖修饰。
 
实验材料和方法
样品制备
rhEPO由中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)或者人胚肾细胞株(HEK)表达。还原的和烷基化的rhEPO经过赖氨酸酶、胰蛋白酶和蛋白酶K进行酶解。赖氨酸酶的浓度为1 : 200,缓冲溶液为20 mMpH 6.0)的醋酸铵,37 ℃恒温2小时。胰蛋白酶的浓度为1 : 100,缓冲溶液为20 mMpH 8.0)的醋酸铵,37 ℃恒温4小时。蛋白酶K的浓度为1 : 50,缓冲溶液为20 mMpH6.0)的醋酸铵,37 ℃恒温1小时。所有的酶均购买自罗氏。
 
1. 促红细胞生成素的氨基酸序列以及糖基化位点
 
液相色谱条件
胰蛋白酶和赖氨酸酶酶解的rhEPO使用Thermo Scientific EASYnLC 1000 HPLC进行分离,使用带有电喷雾喷口的C18色谱柱(20 cmⅹ75 μm I.D.Michrom)。梯度洗脱使用乙腈和0.1%的甲酸,流动相的流速为300 nL/min。其中乙腈的比例在60分钟内从4 %升到30 %,在随后的十分钟内从30 %升高到85 %
 
CESI-MS技术条件
完整的rhEPO使用CESI 8000进行分离,使用中性涂层的毛细管,缓冲液的流速为超低流速。毛细管后连接Exactive Plus EMRThermo Fisher Scientific),在m/z=200处的分辨率为35 K或者140 K。部分酶解产物使用熔融石英毛细管进行分离,后连接Orbitrap EliteThermo Fisher Scientific)或者Orbitrap Fusion Tribrid Thermo Fisher Scientific),在并采用多种二级碎裂方式:FT/IT HCD, CID或者ETD,或者将HCDETD或者CID联系起来使用。Fusion Tribrid质谱在m/z=200一级质谱分辨率设定为60-120 K。二级质谱分辨率为20-60 K
 
数据分析
糖蛋白的分析以及各种糖型的定量使用的软件是ProSightPC 3.0Protein Deconvolution 3.0Pinpoint 1.4以及带有Byonic搜索节点的Proteome Discoverer 2.0。蛋白酶K酶解产物的糖肽以及糖型数据使用SimGlycan 4.5来处理。
 
结果
部分酶解方法(Middle-Down)的重现性
CESI-MS技术是一种根据糖肽所带的电荷以及糖肽的流体半径4对糖肽进行分离分析的方法,它具有灵敏度高,重现性好的特点。我们使用200 ng的样品就能够对EPO的糖肽进行鉴定和定量,并且可以获得不错的信噪比。在次与次之间,分析物的迁移时间和峰面积的重现性很好,RSD小于10 %(图2)。糖肽的分离效果很好,在一次50分钟长的数据采集过程中,样品峰都集中在20分钟内(图2)。
 
O-糖的表征
赖氨酸酶酶解会产生不同长度的包含有Ser126位点的多肽,这些肽段的分子量范围为3-9 kDa(图3),所有的O-糖都只能在FT ETD碎裂方式下被观察到,这是因为O-糖很不稳定,在碰撞碎裂过程中会被破坏掉(图3)。正如我们的预期,CESI-MS技术对于糖型的分离主要是基于唾液酸残基的数目(图4)。在相同的时间内,两类O-糖的肽段(唾液酸的数目为1或者2)在CESI-MS技术中能够基线分离(图4A),但是在nano-LC中不能基线分离(图4B)。rhEPO的几种主要O-糖的丰度总结在表格1中。我们也检测到了一些在Ser126位点没有被糖基化的肽段,所占的比例为9 %(表格1),这就意味着该份样品中此位点只是被部分糖基化。此外我们也检测到了部分Ser9Ser120位点连接有O-糖。
 
2.200ng rhEPO赖氨酸酶酶解产物三次平行实验的基础离子电泳图以及HexNac的二级质谱提取离子流图
 
3.赖氨酸酶酶解得到的O-糖肽段使用Proteome Discoverer 2.0检索得到的结果(114-150A)以及使用ProSightPC 3.0检索的结果(95-150B
 
4. CESI-MS技术(A)以及nano-LC-MSB)分离O-糖糖肽(E114–K150
 
观察EPON-糖检测结果,我们可以发现在同时包含Asn24Asn38两个位点的糖肽中,肽段A1-K45是丰度最高的,而在这两个位点所连的糖型中,HexNAc12Hex14dHex2NeuAc8则是丰度最高的糖型(图5,表格2)。我们不能明确得到每个位点单独的糖型分布。因此,表格2给出的是者两个位点总的糖型分布。在包含有位点Asn83的肽段中,肽段R53-K97是丰度最高的(图6)。值得注意的是,唾液酸数目为1的肽段迁移时间有一些小的改变(约为0.4分钟),这主要是因为唾液酸导致肽段所带负电荷量发生了改变,进而导致肽段的迁移速度发生了改变。在某种程度上,HexHexNAc残基的数目的改变也会影响多肽的迁移速度,主要是因为它影响了多肽的流体半径而不是多肽所带的电荷(图7)。正如我们所料5Asn83位点的主要糖型为四唾液酸修饰的寡糖。
 
5. 使用Proteome Discoverer 2.0 检索到连有两个糖基的N-糖糖肽(A1–K45
 
1.Ser126位点的N-糖糖型分布,糖型的分布根据检测到的所有肽段计算得到
 
2.Ser23/38位点的N-糖糖型分布,糖型的分布根据检测到的所有肽段计算得出,包括乙酰化的和加钠
 
6.使用Proteome Discoverer 2.0 检索赖氨酸酶酶解产物,检索到的N-糖糖肽(R53-K97),采用的碎裂方式分别为HCDA)和ETDB
 
7. CESI-MS技术分离Asn83位的糖型(R53-K97
 
我们也比较了不同细胞株表达的rhEPO的糖肽谱图(图8)。据报道6,重组蛋白上寡糖的结构特征是与细胞株、培养条件以及物种有关的。假设所有糖型的质谱响应是一致的,CESI-MS技术的结果表明在CHOHEK中表达的蛋白,它们的糖型分布是有明显区别的。在HEK细胞株的产物中。Asn83位点最主要的糖型是HexNAc6Hex7dHex1NeuAc4,而在CHO细胞处的产物中,则有大量的四唾液酸位置插入了HexNacHex
 
在非变性条件下表征rhRPO
我们使用中性涂层毛细管在非变性条件下对rhEPO进行分析。中性涂层可以阻止蛋白在毛细管内壁的吸附,从而可以更好地将各个亚型分离。CESI 8000Exactive Plus EMR连接,质谱的分辨率在不同的实验中有所不同。图9A是使用40 mMpH 7.5)醋酸铵分离EPO的电泳图,图9B是对应的离子密度图。分析去卷积之后的质谱图(图10B),当质谱分辨率为140 Km/z=200)时,每个峰包含有167种蛋白亚型,而在分辨率为35 K时,每个峰包含有428种糖型。在这两次实验中,样品的进样量为2.25 ng。丰度最高的糖型为HexNAc19Hex22dHex3NeuAc13,它出现在第四个电泳峰中。结果也表明,不同糖型的分离主要与唾液酸残基的数目有关(图10),这和部分酶解方法的结果(表格3)是相吻合的。由于蛋白很高的异质性,所以分离结果没有达到基线分离。但是通过与高分辨质谱的联用,CESI-MS技术在非变性条件下依然能够比直接进样得到更好的亚型分析结果以及更准确的定量。
 
8.不同细胞系生产的rhRPOAsn83N-糖糖型的对比
 
9.非变性条件下EPO的基础离子电泳图(A)以及对应的离子密度图(B
 
3. 完整EPO和部分酶解产物各个位点的糖型分布,糖型的分布根据检测到的所有肽段计算得到,包括乙酰化的和加钠的峰
 
10. 非变性条件下EPO电泳图中每个峰对应的质谱图以及直接进样的质谱图(A)和它们对应的去卷积质谱图(B),分辨率为140Km/z=200
 
 
结论
 
CESI-MS技术具有重现性好(RSD10%),灵敏度高等特点。在样品消耗量为nano-LC-MS1/5的情况下依然可以获得同样的序列覆盖度和糖肽数目。
CESI-MS技术分离不同的糖型主要是依据所带的唾液酸残基数目的不同(导致电荷数目的不同)以及肽段和糖基的质量比。
 
CHO细胞株生产的rhEPO主要的O-糖糖型为HexNacHex+1(2)NeuAc。在Ser126位点,没有糖基化修饰的比例约为9 %
 
使用CESI-MS技术,采用部分酶解的方法(Middle-Down),比较了不同细胞株生产的rHEPOAsn83位点糖型分布的差异。这也证明了该方法可以对糖蛋白进行深度的表征。
 
对比完整EPO和部分酶解EPO的糖型分布,可以观察到他们之间明显的关联,这也证明了这两种策略结合起来使用可以对具有多个糖基化位点的糖蛋白进行表征。
 
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