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治疗性抗体中糖基的全自动样品制备与快速分析
(发布日期:2016-12-9 9:24:07)  浏览人数:1174
治疗性抗体中糖基的全自动样品制备与快速分析
 
 
在生物制药行业,治疗性抗体产品开发的各个阶段中,对于高通量的N-糖基化分析需求都在不断增大。尤其是在克隆筛选中,大量的样品需要在短时间内进行分析。对于N-糖基化分析,SCIEX公司近期开发了基于磁珠的样品处理方法,取代了当前常用的离心和真空离心的步骤。优化的磁珠方法可在4个小时内完成糖的释放、荧光标记和纯化过程,并具有良好的产率和高的重现性。本文展示了基于磁珠法进行自动化的糖基快速分析的所有步骤。优化了使用高通量自动化工作站和96孔板进行快速内切酶酶解、荧光标记和纯化的过程。同时也优化了毛细管电泳方法,结合激光诱导荧光检测器进行标记糖基的分析,以实现快速分离(<3 min)。
 
溶液态的前处理方法需要较大的工作量,包括在样品分析之前糖基释放、纯化、荧光标记和预浓缩。此外,这种方法需要大量的离心和真空离心的步骤,使自动化工作站的使用变得困难并且昂贵。利用新型的基于磁珠处理样品的方法可以使大量的样品在96孔板中在小于4个小时的时间内完成前处理,并且避免了离心和真空离心的步骤。这个方法已经应用在Biomek FXP 实验室自动化工作站上来制备和分析IgG样品。荧光标记样品可在配有激光诱导荧光检测器的PA 800 Plus毛细管电泳系统中进行超快速的分析,每个样品可在3 min之内完成分离。
 
实验步骤
自动化的样品制备过程在Biomek FXP 实验室自动化工作站上进行,该工作站包括96孔板架、磁力支架、1000 µL25 µL的移液枪头、1/4分隔试剂槽以及样品瓶和试剂瓶(图2)。试剂槽中含有乙腈(Sigma Aldrich, MO)和Agencourt CleanSeq磁珠(Beckman Coulter)。试剂瓶中包含PNGase F酶(Prozyme, Hayward, CA)、溶于20 %醋酸中的APTSSCIEX, Brea, CA)以及1 M氰基硼氢化钠(in THF)(SCIEX, Brea, CA)。为了减少溶剂挥发引起的体积损失,用移液盒盖子将试剂槽盖上。糖蛋白样品在Biomek涡旋加热模块中进行孵育。为了充分离磁珠和悬浮液,将一块装有磁铁的空白板放在样品板下面,这样磁铁离样品管更近,可以快速吸引磁珠到小瓶底部,实现快速分配、悬浮。
 
1. 配置激光诱导荧光检测器的PA 800 Plus毛细管电泳系统(CE-LIF
 
Varadi等人最近发表了磁珠辅助的手动进行样品前处理的步骤[1]。图3展示的是整个工作流程。在50 ℃条件下使用PNGase F进行酶解1小时,随后在87.5%的乙腈中,糖基捕获在磁珠上[2]。加入氰基硼氰化钠和APTS,在37 ℃下对吸附在磁珠上的糖基进行原位的标记反应2小时。荧光标记的糖基在加入25 µL水之后可以从磁珠上洗脱下来,然后在PA800 Plus-LIF上进行分析(激发波长488 nm,发射波长520 nm)。在分离过程中使用N-CHO毛细管(30/20 cm有效/总长度,50 µm内径),背景电解质为含有1 % PEO900,000)的25 mM醋酸锂溶液。分离电压为30 kV,毛细管温度为20 ℃。进样条件为3 psi压力进样6 s。自动化工作站使用4.0版本的Biomek软件(图4)。使用32 Karat软件进行CE-LIF的数据采集和分析。
 
2. Biomek FXP实验室自动化工作站的实验装置
 
 
结果与分析
在这项工作中,我们将之前发表的磁珠辅助糖基释放、APTS标记和样品纯化的方法应用于96孔板的Biomek FX实验室自动化工作站中(图2)。结果表明,使用全自动的样品处理方法可以使样品处理缩短至<3.5小时,并且具有高的回收率和重现性。自动化工作站平台编程简单并且系统灵活实用,可以处理大量的样品。实验室自动化工作站提供了一个快速处理样品的功能,对天然生物样本中,减少了流动引起酶切失败及污染的风险。
 
由于自动化工作站的容量很大,CE-LIF分析用的缓冲液也可在Biomek FX上自动配置,比如自动化完成聚合物的溶解过程。
 
为了配合高通量自动化的样品制备过程,我们也对CE-LIF的快速分析方法进行了优化,从自动化工作站的96孔板中连续进样(图5),在3分钟内lgG糖基即可得以基线分离。这种分离方法可以应用于克隆筛选中大量样品的快速分析。
 
PA800 Plus毛细管电泳系统结合自动化工作站可对lgG的糖基进行快速、高通量的制备和分析。
 
3.治疗性抗体N-糖基化分析中磁珠辅助的样品处理流程
 
4.使用4.0版本Biomek软件在自动化工作站中编辑运行程序
 
5.磁珠辅助自动化工作站结合CE-LIF96lgG的糖基进行快速分析
 
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