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毛细管区带电泳(CZE)对单克隆抗体的电荷异质性分析
(发布日期:2016-9-29 10:27:16)  浏览人数:5481
毛细管区带电泳(CZE)对单克隆抗体的电荷异质性分析
 
 
 
前言
电荷异质性分析对于单克隆抗体的表征是非常重要的,因为它可提供有关产品的质量和稳定性的重要信息。异质性可源于分子层面的改变,如C-末端赖氨酸修饰、脱酰胺化和翻译后修饰。毛细管等电聚焦(cIEF)是一种可以根据蛋白各亚型等电点的变化分离电荷异构体的方法。毛细管等电聚焦(cIEF)需要在涂层毛细管中进行电泳分离,涂层毛细管可以抑制电渗流(EOF)并且可以防止蛋白在管壁表面的吸附,但需要较长的分析时间周期和复杂的样品制备。
 
本文展示了通过使用一个简单的分离缓冲体系和非涂层毛细管,可以在12分钟内对单克隆抗体的电荷异质性进行分析,得到高分辨率和高重现性的分离结果。在本研究中,使用有效长度为20 cm的短毛细管即可获得较高分辨率,若使用有效长度为40 cm的毛细管还可以揭示单克隆抗体的更精细的结构。
 
实验条件
毛细管区带电泳
分离缓冲液的配制:0.05% HPMC , 380 mM EACA, 1.9 mM TETA
400 mM EACA + 2 mM TETApH =5.7)缓冲液的配制

在含有95 mL去离子水的100 mL烧杯中加入5.25 gEACASigma, cat. no. A-7824)和30 μLTETA(三乙烯四胺,Sigma, cat. no. 90460)。充分溶解后,用冰醋酸调节pH5.7±0.05。将上述溶液转移至100 mL容量瓶中,并用去离子水定容。所得溶液用0.2 μm 滤膜过滤。
 
1% HPMC溶液的配制
1g HPMCSigma, cat. no. H-7509)加入到含有100 mL去离子水的烧杯中,室温过夜使其充分溶解。
 
分离缓冲液的配制
移取400 mM EACA + 2 mM TETApH = 5.7)缓冲液8.55 mL15 mL离心管中,加入1% HPMC溶液450 μL,充分混合。每次使用前新鲜配制。这里准备的分离缓冲液量足够运行9次分离。

毛细管冲洗液
0.1 N HCl 溶液(Fluka, part no. 94015)。
 
样品
单克隆抗体X是一种具有代表性的治疗性单克隆抗体。原液为20 mg/ mL的单抗X,用去离子水稀释至1mg/mL,并用于毛细管等电聚焦(cIEF)和毛细管区带电泳(CZE)的分离。

毛细
规格:熔融石英,50 μm内径,360 μm外径。用于高分辨率分离方法的毛细管总长度为50 cm,有效长度为40 cm;用于快速分离方法的毛细管总长度为30 cm,有效长度为20 cm
 
仪器
本次实验使用的仪器是PA 800 plus生物制药分析系统配备UVPDA检测器。使用UV检测器时,在毛细管区带电泳(CZE)实验中配置214 nm的滤光片并且数据采集频率设置为4 Hz,而在毛细管等电聚焦(cIEF)实验中配置280 nm的滤光片。PDA检测器则用于重复毛细管区带电泳(CZE)实验用于之后和UV/vis的数据进行比较。样品储藏温度和卡盒的温度分别为20 ℃25 ℃
 
毛细管区带电泳(CZE)方法
 

结果与讨论
分别运用毛细管等电聚焦(cIEF)和毛细管区带电泳(CZE)的方法对单克隆抗体X电荷异质性进行了分析。典型单克隆抗体X等电聚焦的分离说明其具有复杂的电荷异构体,等电点范围从pI 6.3pI 6.91(图1)。在pH = 5.7的缓冲体系下,由于可能存在潜在蛋白溶解度问题1,我们并不能确认使用毛细管区带电泳(CZE)分离是否能够对此样品进行有效的分离。然而,实验结果表明,虽然该单克隆抗体是弱酸性的,且其等电点与分离缓冲液的pH值相差不到1pH单位,但毛细管区带电泳(CZE)方法在12分钟内就可以获得完全的高分辨的分离(图2)。
 
1. 单克隆抗体X的毛细管等电聚焦(cIEF)电泳图,单克隆抗体的浓度为1 mg/mL
 
2. 单克隆抗体X在毛细管区带电泳(CZE)条件下的电泳图和积分。电荷异构峰分别归类为碱性峰,主峰和酸性峰。毛细管区带电泳(CZE)条件:单克隆抗体X 1 mg/mL;分离缓冲液:0.05% HPMC380 mM  EACA(氨基己酸),1.9 mM  TETA;熔融石英毛细管,30 kV分离电压。
 
结果表明,毛细管区带电泳(CZE)的分离方法可以实现高分辨率的分离(图3)。此外,在碱性峰区域的分辨率优于毛细管等电聚焦(cIEF)。毛细管区带电泳(CZE)的一个重要的优势是不仅仅分辨率高,而且分析速度快。得到完整的电荷异质性分离分析,毛细管区带电泳(CZE)只需要12分钟而毛细管等电聚焦(cIEF)则需要23分钟。

实验的重复性是十分重要的,在这里进行了连续多次的毛细管区带电泳(CZE)运行来说明其分离重现性(图4)。按照图2的方式对这些数据进行积分(图5),得到碱性峰、主峰和酸性峰群。连续多针运行结果表明毛细管区带电泳(CZE)分离具有杰出的重现性,其酸性峰、主峰和碱性峰的校正峰面积RSD小于3%,迁移时间RSD小于0.55%(表1)。
 

1. 毛细管区带电泳(CZE)分析单克隆抗体X的原始数据。碱性、中性和酸性样品峰的矫正峰面积和迁移时间的重现性
 

3. 单克隆抗体X的毛细管等电聚焦(cIEF)和毛细管区带电泳(CZE)分析方法对比
 

4. 单克隆抗体X的毛细管区带电泳(CZE)分离。9针连续的分离均使用UV检测器。单克隆抗体X的浓度为1 mg/mL;缓冲液:0.05% HPMC380 mM EACA1.9 mM  TETA;熔融石英毛细管,30 kV分离电压

 

5. 分析单克隆抗体X 32 Karat软件积分参数
 
毛细管区带电泳(CZE)还具有很大的灵活性,不同检测器的类型都能提供相同的性能。使用毛细管区带电泳(CZE)的方法无论配置二极管阵列检测器或是紫外检测器对单抗X进行分离都可以获得相同的分辨率。此外,使用这两种检测器还可得到相同的组分面积百分比(图6)。

若希望获得更高的分辨率,可通过增加毛细管的有效长度,能得到比快速分离的方法更精细的分离。如图7所示,使用有效长度为40 cm的毛细管对单克隆抗体X进行分离,尽管总分离时间有所增加,但高分辨率有了明显的提高。

更高的分辨率有利于对单克隆抗体X的降解状态(如暴露在60 ℃48个小时)进行分析。然而,只有增加毛细管的有效长度,才有可能看到因为热不稳定性形成的酸性峰和碱性峰的精细结构。

6. 使用UVPDA检测器进行毛细管区带电泳(CZE)分离的对比。UV检测器(红色),PDA检测器(黑色)。分离条件均如图1所述
 

7. 不同毛细管有效长度的结果对比。毛细管区带电泳(CZE)分离条件如前所述。40 cm有效长度(下图),20 cm有效长度(插图)
 

8. 单克隆抗体X在高温下(60℃)暴露5天降解后的分析。分别使用40 cm毛细管有效长度(下图)和20 cm毛细管有效长度(插图)进行毛细管区带电泳(CZE)的分离
 
结论
使用毛细管区带电泳(CZE)和毛细管等电聚焦(cIEF)的方法都可以很容易的检测蛋白质电荷异质性。毛细管等电聚焦(cIEF)通常用于获得电荷异质性和等电点的信息,而本文介绍的毛细管区带电泳(CZE)方法具有对典型单克隆抗体快速及高重现性分离的能力。该毛细管区带电泳(CZE)方法可以通过增加毛细管的有效长度进行提高峰分辨率的优化。毛细管区带电泳(CZE)分离的性能不受检测器的影响,毛细管区带电泳(CZE)可以在碱性峰、主峰和酸性峰分离中表现出很好的重现性。基于上述优势可见,毛细管区带电泳(CZE)是一种可以替代毛细管等电聚焦(cIEF)的快速分析方法,在保证分离效果和重现性的同时,为高通量分析提供了可能。

REFERENCES
1. Yan He, Colleen Isele, Weiying Hou, Margaret Ruesch. 2011. Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. Journal of Separation Science, vol. 34: pages 548-555.

2. Ingrid D. Cruzado-Park, Scott Mack and Chitra K. Ratnayake, A Robust cIEF Method: Intermediate Precision for the pH 5-7 Range, PN A-12015

 
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