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RTCA技术与MTT对比
(发布日期:2015-8-27 10:54:49)  浏览人数:1950
RTCA技术与MTT对比
 
RTCA技术简介:
 
    原理:实时无标记动态细胞分析技术(RTCAReal Time Cellular Analysis)是通过特殊工艺,将微电子细胞传感器芯片整合到细胞检测板的底部,用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时,这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性,通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息,包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等。

 
RTCA技术细胞增殖及毒性检测实验步骤:

1、向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
2、收集对数期细胞并计数,调整细胞悬液浓度,向E-Plate检测板中加入一定体积的细胞,室温超净台内放置30min
3、将加入细胞的E-Plate检测板放入检测台上(检测台预先放入培养箱中),进行实时动态的细胞增殖检测。
4、过夜检测后,向各培养孔中加入配制好的梯度药物并继续进行实时动态检测, 即可获得化合物介导的细胞效应曲线及不同时间段IC50值。

RTCA实时无标记技术细胞增殖及毒性检测实验流程:
 
 
特点:
 

1、实验操作简单,步骤少,人为误差小。
2、采用无标记方法,不存在标记效率问题,并且对细胞无损伤,细胞在最接近生理状态下进行检测,结果准确度高。
3、实验结果客观,重复性好,不需设置重复孔(实验操作需规范,如有特殊要求也可设置重复孔)。
4、因预先对基础阻抗值测定,所以无需设置空白对照孔。
5、完整细胞效应图谱,提供大量、重要的动态反应信息。

 

典型的利用RTCA技术获得的细胞增殖实验检测结果:

 

接种不同密度的A549细胞获得的细胞增殖实时动态曲线
 
利用RTCA技术获得的典型的细胞毒性实验检测结果:
 
 
Taxol引起的浓度依赖性作用曲线及软件自动生成的IC50
 

MTT法简介:

原理:MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。

 

MTT实验步骤:

1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000/孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
25%CO237孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)。
3、加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。
45% CO237孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
5、每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
6、终止培养,小心吸去孔内培养液。
7、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
8、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

 

MTT检测结果:

 

                          MTT法细胞增殖实验检测结果                 典型的MTT法细胞毒性实验检测结果
 

 

RTCA技术与MTT优势对比:

 

 

RTCA技术

MTT

 标记物

 无,对细胞无伤害

 有,对细胞有伤害

 实验数据

 连续的实时动态曲线

 终点检测(单点数据)

 实验步骤

 简单

 繁琐

 实验重复性

 

 

 实验数据获取

 自动

 手动

 细胞活性信息

 粘附、活力、形态

 活力

 时间量效检测

 一次,同时获取

 多次实验

 数据准确性

 

 

 实验耗时

 

 

 检测过程

 培养箱内进行(正常生长环境)

 培养箱外(非细胞生长环境)

 实验后的细胞样品

 可用于其他细胞检测实验

 只能丢弃

 预测细胞毒性作用机制

 可以

 不能

 动态IC50

 可以

 不能

 实验结果实例

 

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